Archívum

A nukleinsavvizsgálati technikák közül a high-throughput szekvenálás az egyik legfontosabb eszközzé vált mind kutatási, mind diagnosztikai szempontból. A mikrobiális genom nukleotidsorrendjének meghatározása megerősíti egy adott kórokozó jelenlétét, segít a kórokozó genomfelépítésének és genetikai változásainak megismerésében.

A nukleinsavállomány kinyeréséhez, előkészítéséhez, és a DNS könyvtár előállításához számtalan kereskedelmi forgalomban kapható kit áll rendelkezésre. A hosszú szekvenciák generálására alkalmas (long read sequencing) rendszerek a rövid szekvenciák előállítására tervezettekkel (short read sequencing) szemben érzékenyebbek a nukleinsav fragmentálódása szempontjából, így nagy gondot kell fordítani a megfelelő izolálási technológia kiválasztására.

Tanulmányunk célja bakteriális genomok long read szekvenálásának (nanopórus szekvenálás) előkészítésére legalkalmasabb DNS extrakciós kitek kiválasztása és tesztelése volt. Ehhez két manuális (a filteres oszlop alapú Zymo Research Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep Kit, és folyadék centrifugáláson alapuló InviPrep Fast Lysis Buffer), valamint két automata, mágnesgyöngy alapú izoláló rendszer kitjeit (MagCore Genomic DNA Bacterial Kit, és MagnifiQ 1 Genomic DNA instant kit) vetettük össze.Szakirodalmi adatok és laboratóriumunk tapasztalatai alapján a Zymo kit alkalmas long read szekvenálás előkészítésére, így ez szolgált az összehasonlítások alapjául. Folyékony tápoldatban szaporított Pseudomonas aeruginosa baktériumtörzseket (n=6) ideális növekedési fázisukban szétosztottunk, centrifugáltunk, majd a kitek leírásának megfelelő oldatokban szuszpendáltunk. DNS kivonást követően az eluátum koncentrációját lemértük, majd DNS könyvtárat készítettünk és szekvenálást végeztünk Nanopore Native Barcoding kit felhasználásával, MinION mk1b készülékkel. A szoftveres feldolgozást követően összevetettük a leolvasott átlag readhosszt és minőséget, a read és bázis számot, és az N50 readhossz értékét.

Bár a Zymo kittel történő tisztítás vette igénybe a legtöbb időt, readhosszúság tekintetében ez bizonyult a legideálisabbnak. A legmagasabb DNS koncentrációt a Magcore kittel állítottuk elő, de a readek hossza elmaradt az előbbihez képest. A másik két kit esetében mind a nukleinsav koncentráció, mind a readek hossza elmaradt a Zymo kittel elérthez képest.

Bár a Zymo kithez képest mindhárom DNS tisztítási módszer rövidebb protokollt jelent, readhosszúság tekintetében nem ideálisak a long read szekvenálásra. Mivel a korábban alkalmazott kittel nyert DNS koncentrációja és fragmensmérete is megfelelő a könyvtár előkészítéshez, vizsgálatainkat továbbra is erre alapozzuk. A különböző rendszerek fejlesztésével azok alkalmasságát a jövőben folyamatosan vizsgáljuk.