A nyugat-nílusi vírus virulencia markereinek vizsgálata
Kuczmog Zita V. évfolyam
SzIE, Állatorvos-tudományi Kar, Járványtani és Mikrobiológiai tanszék
Témavezetők: Dr. Bakonyi Tamás, Dr. Szentpáli-Gavallér Katalin

Absztrakt:

A nyugat-nílusi vírus (WNV) egyes törzsei jelentős eltéréseket mutatnak neuroinvazivitás vonatkozásában. A WNV kettes genetikai vonalához tartozó teljes hosszúságú fertőző klón előállításával lehetőség nyílik különböző, a vírus pathogenitását esetlegesen befolyásoló genetikai markerek vizsgálatára, a vírus genetikai anyagának módosításával.

A teljes hosszúságú fertőző klón előállítása két különböző módszerrel, párhuzamosan történt. Első lépésként a Vero (afrikai zöld majom vese epithel) sejteken elszaporított vírus tisztított RNS-éből egyszálú komplementer DNS készült, genomspecifikus primerek segítségével. A genomspecifikus primerek tervezése a kiindulási vírus szekvencia analízise alapján történt.

Az első módszer alapja a vírus teljes genomját lefedő, egymást átfedő polimeráz láncreakciók termékeiből felépülő fúziós PCR-ek sorozata volt. Az így kapott teljes hosszúságú, duplaszálú DNS másolat, kiegészítve a humán cytomegalovírus (CMV), illetve a T7 bakteriofág promoterrel, került transzfekció útján BHK-21 (újszülött hörcsög vese) sejtekbe.

A második módszer lényege a vírus teljes genomját tartalmazó cDNS pBeloBAC alacsony kópiaszámú plazmidba való beépítése volt. Az átfedő PCR termékek, illetve a plazmid restrikciós enzimekkel való emésztése után a vírus teljes genomjának megfelelő DNS három darabban, ligálással került a plazmidba. A kiindulási plazmid tartalmazta a CMV promotert. Végül a vírus teljes genomját tartalmazó plazmid (CMV-WNV) E. coli DH10B kompetens sejtekben lett felszaporítva. A transzkripció in vivo (CMV promoter által, BHK-21 sejtekbe történt transzfekció után), illetve in vitro módszerrel (mESSAGE mACHINE kit, Ambion) is történt.

A genom módosítása irodalmi adatok alapján olyan aminosav változtatásokra épült, amelyek lineage 1-hez tartozó WNV törzsekben különböző mértékű attenuálódáshoz vezettek in vitro illetve in vivo modellállatokban. A pontmutációk genomspecifikus primerekkel történtek, amelyek tartalmazták a kívánt nukleotid szekvenciát. A módosított genomszakasz a plazmid restrikciós enzimekkel való emésztése és ligálás útján került a CMV-WNV plazmidba. A klónvírusok BHK-21 sejtekben in vivo transzkripció útján keltek életre.

Az in vitro jellemzés során, egyes aminosav változást tartalmazó vírusok növekedése Vero sejteken eltérést mutatott a kiindulási vírushoz képest.

A kutatás a VECTORIE EU FP7 projekt támogatásával történt.

Előadások listája